1 2 3 4 5 6
далее ина. Нет также данных и о генетических связях названных штаммов с типичны-ми вирулентными и авирулентными штаммами холерного вибриона Эль-Тор. Целью нашей работы явилось изучение молекулярно-генетических и фенотипических свойств нетоксигенных вибрионов Эль-Тор, выделенных от больных. Материалы и методы В работе использовали 20 штаммов V. cholerae серогруппы 01 биовара Эль-Тор, которые хранились в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" в лиофилизированном состоянии. В качестве питательных сред применяли бульон и агар Хоттингера и Мартена (рН 7,6), бульон и агар LB. Продукцию фосфолипазы определяли, выращивая клетки на элективно-дифференциальной среде с добавлением 2% эмульсии яичного желтка в физиологическом растворе [25]. Результаты учитывали по размеру зоны просветления субстрата вокруг макроколоний. Продукцию растворимой гемагглютининпротеазы выявляли путем посева культур на агар, содержащий 10% обезжиренного молока [16]. Размер зоны протеолиза вокруг макроколонии свидетельствовал о количестве продуцируемого фермента изучаемыми штаммами. Гемолитическую активность штаммов определяли чашечным методом на плотной питательной среде с добавлением 3% бараньих эритроцитов. Количество продуцируемого гемолизина устанавливали по размеру зоны гемолиза вокруг макроколоний. Вирулентность изучаемых штаммов определяли путем внутрикишечного заражения крольчат-сосунков [14] и внутрибрюшинного инфицирования белых мышей [17]. Токсигенность штаммов выясняли путем введения в изолированную петлю тонкой кишки взрослого кролика 1 мл LB-бульона, содержащего 107 микробных клеток (м. к.) [13]. ПЦР проводили по описанному ранее методу в микропробирках объемом 600 мкл на программируемом термостате "Терцик" (ЗАО "НПФ ДНКТехнология", Москва) [10]. Присутствие генов патогенности в хромосоме изучаемых штаммов V. cholerae биовара Эль-Тор определяли с использованием олигонуклеотидных праймеров, представленных в табл. 1. Для молекулярного типирования использовали три различных праймера — пару праймеров pS, созданных на основе нуклеотидных последовательностей, фланкирующих тандемные повторы бактериофага М13 [9], а также случайные праймеры 1281 и 2 для однопраймерной ПЦР [12, 27]. Праймеры синтезировали в НПФ "Литех" (Россия) на автоматическом синтезаторе ДНК АСМ102U (ТОО "Биоссет", Россия). Расчет молекулярной массы амплифицированных фрагментов осуществляли на основе программы DNASIS, v. 3.0 (Hitachi Software Engineering Co., LTD). В работе использовали маркеры молекулярных масс фирмы "MBI Fermentas" (Литва): GeneRuler™ 50bp DNA Ladder и GeneRuler™ 100bp Cканирование подученных фотографий электрофоретических гелей проводили с использованием планшетного сканера Mustek 1200 СР, цифровые изображения обрабатывали в редакторе Adobe Photoshop, v. 7.0. Результаты и обсуждение Отсутствие в геноме штамма М1333, выделенного от больного холерой в Челябинске, лишь гена ctxA побудило нас провести более глубокий анализ его генома. В первую очередь необходимо было выяснить, лишен далее ...